AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIMICROBIANO DOS EXTRATOS DE ALHO, GENGIBRE E ORÉGANO EM CULTURAS DE Helicobacter pylori
Carlos Eduardo Coral de Oliveira1; Patricia Stadler Rosa Lucca1; Ligiane de Lourdes da Silva1; Pamela Marca2; Francielly Alberti Duarte2
Faculdade Assis Gurgacz ,Cascavel, Paraná
RESUMO
Cerca de mais da metade da população humana é colonizada pela Helicobacter pylori (H. pylori), uma bactéria Gram-negativa microaerofílica. Se não tratada, a infecção pode perdurar por muitos anos e leva a patologias gástricas severas, incluindo úlceras gástricas e duodenais, além de linfomas e adenocarcinomas gástricos. As propriedades biológicas do alho (Allium sativum) e do orégano (Origanum vulgare) são amplamente relatadas, e vem sendo demonstrado o efeito bactericida de seus extratos sobre o H. pylori. Os efeitos terapêuticos do alho incluem atividades antioxidante, anti-cancerosa, anti-inflamatória, hipoglicemiante, imunomoduladoras, além de efeitos sobre o sistema cardiovascular e endócrino. Estudos recentes têm demonstrado que o extrato de orégano apresenta atividade antioxidante, antimicrobiana e imunomoduladora. Outra espécie que possui várias propriedades medicinais é o gengibre (Zingiber officinale Roscoe). Suas ações já foram comprovadas através de estudos científicos, citando-se as atividades: antiinflamatória, antiemética, antináusea, antimutagênica, antiúlcera, hipoglicêmica, antibacteriana, entre outras. Os gingeróis e os shogaóis são os compostos fitoquímicos responsáveis pela atividade farmacológica antimicrobiana do gengibre. Embora estudos tenham demonstrado a atividade antibacteriana isolada dos extratos derivados destas plantas, a associação destes ainda não foi observada sobre cultura de H. pylori. Esta associação de plantas medicinais e antibióticos poderia otimizar o tratamento de pacientes com úlcera, por apresentarem ação sinérgica. Neste contexto, este projeto pretende avaliar a atividade anti-H. pylori dos extratos aquosos, isolados e conjuntos, de alho, gengibre e orégano, através do método de concentração inibitória mínima.
Palavras-chave: Helicobacter pylori, antimicrobianos, plantas medicinais.
1 INTRODUÇÃO
Centenas de plantas distribuídas por todo o mundo são usadas na medicina tradicional para o tratamento de infecções bacterianas. Algumas destas têm sido utilizadas em estudos de screening in vitro para a avaliação dos seus efeitos. Entretanto, a eficácia das drogas vegetais continua sendo questionada.
A terapia antibiótica com drogas convencionais é efetiva no tratamento das infecções bacterianas, mas os problemas com a resistência bacteriana vêm aumentando, exigindo a constante busca por novas soluções e terapias (MARTIN & ERNST, 2003). Tem sido crescente a investigação da potencialidade antimicrobiana de produtos vegetais (ANDREMONT, 2001).
Embora os produtos naturais não sejam necessariamente mais seguros aos antibióticos sintéticos, alguns pacientes preferem fazer uso de medicamentos fitoterápicos. As plantas são conhecidas por serem fonte de compostos fitoquímicos que são benéficos para a saúde e poderiam também prevenir doenças. Inúmeros estudos têm sido propostos com o intuito de se encontrar novos agentes antimicrobianos de plantas contra vírus, bactérias e fungos.
A infecção pelo Helicobacter pylori atinge 70 a 90% da população dos países em desenvolvimento. Todos os pacientes desenvolvem inflamação gástrica crônica, mas esta condição geralmente é assintomática. Esta gastrite não constitui uma doença por si só. É conhecido que o H. pylori é o agente etiológico de quase todos os casos de úlcera péptica em adultos e que o tratamento que erradica a bactéria leva a cura das úlceras. A presença de infecção por H. pylori também está fortemente associada com o risco de desenvolvimento de atrofia gástrica, que se caracteriza como uma lesão precursora ao câncer gástrico (DUNN et al, 1997).
Assim, o H. pylori está associado aos adenocarcinomas do estômago, na porção distal. A infecção também se relaciona com o desenvolvimento de tumores difusos no estômago e no intestino. Esta associação é extremamente importante uma vez que, do total, o câncer gástrico é a segunda maior causa de morte por câncer no mundo (NEUGUT et al, 1996).
A terapia atual e mais efetiva no tratamento de úlceras pépticas consiste de três agentes farmacológicos: um inibidor da bomba de prótons, como o omeprazol, e dois antibióticos, claritromicina e amoxicilina ou metronidazol. Entretanto, a prevalência dos distúrbios associados à resistência aos antibióticos tem aumentado, principalmente em algumas regiões do mundo.
A investigação de úteis e viáveis compostos alternativos para a erradicação e controle das infecções bacterianas tem sido impulsionada pela crescente preocupação deste tema em saúde pública. Estudos científicos realizados com especiarias, seus produtos derivados e plantas têm mostrado resultados satisfatórios na eliminação de microorganismos (KINZIL; SOGUT, 2003).
Neste contexto, vários estudos têm buscado observar os efeitos antimicrobianos dos extratos de plantas contra o H. pylori (O’MAHONY et al., 2005).
O uso do alho (Allium sativum) na dieta e na medicina tem sido preservado durante séculos. A maior parte dos seus efeitos profiláticos e terapêuticos é devida aos compostos organosulfurosos específicos, solúveis em água e em óleo, que são responsáveis pelo odor e sabor típicos do alho (SIVAM, 2001).
O orégano (Origanum vulgare), considerado pelos antigos romanos como símbolo da paz e da felicidade, além de ser utilizado como tempero, apresenta propriedades terapêuticas. Seus componentes ativos estimulam as funções gástricas e biliares, auxiliando nas dispepsias, enjôos e estomatites. Os efeitos terapêuticos antimicrobianos do orégano são devidos principalmente aos compostos fenólicos do seu extrato, como o ácido rosmarínico (LIN et al., 2005).
Outra espécie que possui várias propriedades medicinais é o gengibre (Zingiber officinale Roscoe). Suas ações já foram comprovadas através de estudos científicos, citando-se as atividades: antiinflamatória, antiemética, antináusea, antimutagênica, antiúlcera, hipoglicêmica, antibacteriana, entre outras (WHO, 1999; UTPALENDU et al., 1999).
Embora estudos tenham demonstrado a atividade antibacteriana isolada dos extratos derivados destas plantas, a associação destes ainda não foi observada sobre cultura de H. pylori. Segundo Nostro e colaboradores (2006), a associação de plantas medicinais e antibióticos otimizaria o tratamento de pacientes com úlcera, por apresentarem ação sinérgica.
Desta forma, este trabalho propõe-se a avaliar os efeitos antimicrobianos dos extratos aquosos do alho (Allium sativum), do gengibre (Zingiber officinale Roscoe) e do orégano (Origanum vulgare) em cultura de Helicobacter pylori, através do método de diluição em ágar.
2. ASPECTOS GERAIS DO Helicobacter pylori
Em meados dos anos 80, o Helicobacter pylori foi inicialmente isolado de biópsias gástricas submetidas a exames histológicos. Estes organismos não estavam presentes na mucosa gástrica, mas na camada de muco que reveste o tecido do estômago (MARSHALL, 1989; WARREN & MARSHALL, 1983).
Atualmente, o H. pylori está associado com importantes doenças envolvendo o tecido gastroduodenal. É conhecido que a infecção por H. pylori está fortemente associado à presença de inflamação na mucosa gástrica (gastrite superficial crônica), e especialmente com a infiltração de células polimorfonucleares (gastrite crônica ativa). Evidências têm indicado que uma vez adquirido, o H. pylori persiste por toda a vida do indivíduo, ao menos que seja erradicado pela terapia antimicrobiana (BLASER, 1992; BLASER, 1997).
Além disso, tem sido descrito a presença da bactéria em ulcerações duodenais e gástricas, e que ela está ligada ao desenvolvimento de adenocarcinomas de estômago, linfoma não-Hodgkin gástrico, desordens linfoproliferativas e linfomas de tecido linfóide (EIDT; STOLTE; FISCHER, 1994; WOTHERSPOON et al.; 1992). Salienta-se que a erradicação do H. pylori com antimicrobianos em pacientes com linfoma leva a regressão do tumor (BAYERDORFFER et al., 1995; WALT, 1996; WOTHERSPOON et al., 1993).
O H. pylori frequentemente é encontrado em estômagos de humanos em todas as partes do mundo (além de comumente isolado de primatas não humanos). Nos países desenvolvidos observou-se que a maioria da população portadora do H. pylori adquiriu a infecção antes dos 10 anos de idade (TAYLOR; PARSONNET, 1995).
Nenhum reservatório substancial do H. pylori foi encontrado, a não ser o estômago humano. Portanto, quanto à transmissão, acredita-se que o H. pylori seja capaz de migrar do estômago de um indivíduo para o outro, por uma destas três vias: iatrogênica, através de tubos, endoscópios ou instrumentos médicos; fecal-oral, talvez o mais importante; e oral-oral (KATOH et al., 1993; KLEIN et al., 1991; MEDRAUD, 1995; THOMAS et al., 1992; TYTGAT, 1995). Nenhuma associação com a infecção através da transmissão sexual foi identificada.
O H. pylori é uma bactéria gram-negativa, microaerofílica, espiralada, com tamanho aproximado de 0,5 a 1,0 μm. Apresenta de quatro a seis flagelos, essenciais para a motilidade bacteriana.
O genoma da bactéria é composto por aproximadamente 1,67 milhões de bases nitrogenadas, além de plasmídios de 1,5 até 23,3 mil bases, que não constituem fatores de virulência bacteriana. Devido às localizações variáveis entre inúmeros genes no mapa genético do H. pylori, acredita-se que ocorram altas taxas de rearranjo gênico (BUKANOV; BERG, 1994; JIANG; HIRATSUKA; TAYLOR, 1996; TAYLOR et al., 1992).
Os isolados de H. pylori exibem atividade quinase para glicose, que está associado com a membrana celular. Além disso, foi identificada uma atividade enzimática característica da via das pentoses neste microorganismo (MENDZ; HAZELL, 1992).
Estudos do metabolismo do H. pylori estão rapidamente expandindo a compreensão básica deste importante patógeno. Entretanto, a identificação de uma via única de metabolismo, que poderia servir como alvo terapêutico com mínimos efeitos para o hospedeiro, ainda não foi descrita.
In vitro, cepas de H. pylori são suscetíveis a uma infinidade de agentes antimicrobianos. Mas, existem controvérsias entre os testes de susceptibilidade in vitro e a resposta do paciente a terapia (van ZWET; THIJS; GRAAF, 1995; WEEL et al., 1996).
Os antibióticos utilizados no tratamento das infecções por H. pylori são principalmente: o metronidazol, a claritromicina ou a amoxicilina, e um inibidor da bomba de prótons, como o omeprazol. Embora a terapia antibacteriana descrita seja utilizada com freqüência, a prevalência da resistência bacteriana a estes agentes tem atingido 70% em alguns países (GLUPCZYNSKI, 1992; OLSON; EDWARDS, 1995; REDDY et al., 1996).
Desta forma, a busca por terapias alternativas ou complemetares torna-se, de fato, um alvo importante para novas pesquisas, contribuindo com a redução dos índices de resistência bacteriana e na recuperação dos portadores.
3. PRINCIPAIS ASPECTOS DO ALHO
O alho é uma hortaliça, da família Liliaceae, formada por bulbilhos (dentes), em número variável, consistindo num bulbo, sendo protegidos individualmente por uma túnica e coletivamente por outra túnica de folhas secas. É um produto reconhecido pelo seu valor medicinal e usado principalmente como tempero.O alho adquiriu uma reputação como agente medicinal terapêutico e profilático formidável em muitas culturas (BANERJEE; MAULIK, 2002). Esta espécie tem atraído uma atenção especial na medicina moderna devido a sua utilização em todo o mundo e pela crença em um produto que proporciona boa saúde e vigor mental.
Até o momento, muitos estudos têm relatado inúmeros efeitos experimentais e clínicos favoráveis das preparações de alho, incluindo seus extratos. O alho fresco macerado tem sido utilizado amplamente nos estudos científicos por ser a forma mais comum de consumo e por consistir essencialmente do extrato aquoso desta hortaliça.
A alicina (alil 2-propenotiossulfinato ou dialil tiossulfinato) é conhecida por ser o principal composto bioativo presente nos extratos aquosos do alho e no alho fresco macerado. Quando o alho é picado ou esmagado, a enzima alinase é ativada e age na alina (presente no alho íntegro) para produzir a alicina. Outros compostos sulfurados presentes no alho macerado são o alil metil tiossulfonato, 1-propenil alil tiossulfonato e γ-L-glutamil-S-alquil-L-cisteína. A concentração de adenosina aumenta várias vezes quando o macerado é incubado em temperatura ambiente.
A enzima alinase, responsável pela conversão da alina (S-alil cisteína sulfóxido) em alicina é inativada pelo calor. Então, o extrato aquoso do alho aquecido contém principalmente alina. A composição do alho em pó, ou seja, preparado pela pulverização e desidratação, apresenta essencialmente a mesma atividade da alinase que o alho fresco. Entretanto, a temperatura de desidratação não deve exceder 60ºC, acima da qual a alinase é inativada (LAWSON, 1998).
Outra preparação amplamente pesquisada é o extrato de alho envelhecido (EAE). Esta preparação refere-se ao alho fresco fatiado, estocado em etanol a 10-20% por um período de 20 meses. Todo este processo pode contribuir para a redução da alicina e aumento da atividade de certos compostos, como a S-alil-cisteína (SAC), S-alilmercaptocisteína, alixina e selênio que são estáveis, altamente biodisponíveis e significativamente antioxidantes (BOREK, 2001). Outro composto antioxidante recentemente identificado do EAE é o N-alfa-(1-deoxi-D-fructos-1-il)-L-arginina (Fru-Arg) que não está presente no alho fresco e no alho aquecido (RYU et al., 2001).
A obtenção do óleo de alho, utilizado medicinalmente, se dá pelo processo de destilação por arraste de vapor. O produto obtido consiste em dialil (57%), alil metil (37%) e dimetil (6%) mono e hexa sulfito.
As principais ações de seus princípios ativos têm sido atribuídas a: i) redução dos fatores de risco das doenças cardiovasculares e do câncer, ii) estimulação do sistema imune, iii) aumento da detoxificação de xenobióticos, iv) hepatoproteção, v) efeito antimicrobiano e vi) efeito antioxidante.
A principal substância pungente que compõe o sabor característico do alho é o dialil dissulfeto que compõe aproximadamente 70% dos compostos voláteis deste produto (WU et al., 1996).
4. PRINCIPAIS ASPECTOS DO ORÉGANO
O orégano (Origanum vulgare), pertencente à família Lamiaceae, é uma erva perene na forma de arbusto e nativa das regiões Euro-Siberiana e Irano-Siberiana, sendo atualmente descritas 38 espécies deste gênero no mundo (ALIGIANIS et al., 2001).O orégano possui várias características químicas e aromáticas, que são amplamente utilizados como insumos na indústria farmacêutica e cosmética, como erva culinária, como flavorizante de alimentos, em bebidas alcoólicas entre outros (ALIGIANIS et al., 2001).
Vários estudos relacionados aos diferentes extratos e óleos essenciais de Origanum vulgare têm demonstrado atividade antiinflamatória, antioxidante e propriedades antimicrobianas (MILOS et al., 2000). Dentre os principais compostos químicos do orégano, usando extratos aquosos e óleos essenciais foram identificados: flavonóides como a apigenina e a luteolina, agliconas, álcool alifáticos, compostos terpénicos, derivados do fenilpropano, ácidos cumérico, ferúlico, caféico, r-hidroxibenzóico e vanilínico (PASCUAL, 2001).
A atividade antimicrobiana está correlacionada aos fenóis carvacrol e timol, que possuem uma maior atividade contra microorganismos gram-negativos (EXARCHOU, 2002).
5. PRINCIPAIS ASPECTOS DO GENBIBRE
O gengibre (Zingiber officinale Roscoe), da família Zingiberaceae, é uma planta herbácea perene, cujo rizoma é amplamente utilizado em função de seu emprego alimentar, industrial e popular medicinal (DAHLGREN et al., 1985; TAVEIRA MAGALHÃES, 1997).O gengibre é uma planta que apresenta de 1-3% de óleos essenciais (os sesquiterpenos), 2,5 a 5% de princípios picantes (o gingerol e shogaol) e 60% de amido. Os gingeróis, principalmente o [6]-gingerol são identificados como os maiores constituintes dos rizomas de gengibre frescos e têm sido atribuídos a eles vários efeitos farmacológicos: analgésico, antipirético, atividade anti-hepatotóxica, antinauseante e antiinflamatória (SURH et al., 2002).
Basicamente os gingeróis e shogaóis são os responsáveis pela maior parte das atividades terapêuticas do gengibre. O shogaol, que é um produto da quebra de gingerol produzido durante a secagem, é duas vezes mais pungente que o gingerol (SURH et al., 2002). A ação deste composto está relacionada com a ação antipirética, analgésica e antiinflamatória, inibindo principalmente a atividade da lipoxigenase (LEVY, 2006).
A atividade antimicrobiana do gengibre vem sendo amplamente pesquisada. Estudos demonstram que óleos e extratos do Zingiber officinalle apresentam ação inibitória em bactérias gram positivas e gram negativas, porém ainda há poucos estudos que relacionam o gengibre ao H. pylori (ALZOREKY; NAKAHARA, 2003).
6. METODOLOGIA
Cinco cepas em cultura de H. pylori provenientes da Universidade Estadual de Londrina (UEL), do Laboratório de Imunologia/Genoma IV, serão adquiridas para realização dos testes.
Seguindo a Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluição para Bactéria de Crescimento Aeróbico, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, em tradução permitida pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), as bactérias serão repicadas em ágar chocolate enriquecido, em temperatura de 2-8ºC, por no máximo uma semana.
Antes do teste, será realizado subcultivos das cepas em placas de agar Müeller-Hinton (MH) e sangue de carneiro envelhecido (> 2 semanas) (5%v/v), a fim de se obter colônias isoladas.
As colônias são cultivadas ou suspensas para os testes de acordo com as técnicas recomendadas de preparação de inóculos, que consiste de uma suspensão salina equivalente à solução padrão de McFarland 2,0 (contendo de 1 x 107 a 1 x 108 UFC/mL), a ser preparada a partir de uma subcultura de 72 horas de uma placa de agar MH/sangue.
A preparação dos extratos de alho, gengibre e orégano foi realizada, à partir de duas concentrações: 5mg e 40mg/mL de alho descascado em solução salina estéril; 100mg e 200mg/mL de folha seca de orégano água destilada autoclavada; e 100mg e 200mg/mL de pedaços de rizoma de gengibre água destilada autoclavada. Todos os extratos foram feitos em triplicata, e passaram por processo de esterilização por filtração, em filtro micropore 0,4μm. Alíquotas dos extratos serão incorporadas ao meio de cultura, em diluições seriadas, para a realização dos testes de CIM.
O inóculo (1-3μL por ponto) é semeado diretamente nas placas de diluição em agar contendo os extratos vegetais. As placas serão incubadas a 35o C ±2 graus, por três dias, em atmosfera microaeróbica. O acompanhamento do crescimento bacteriano será realizado diariamente.
O controle positivo consistirá de bactérias cultivadas em ágar sem adição dos extratos vegetais, seguindo as mesmas condições de cultivo. O teste de esterilidade das placas servirá como controle negativo de crescimento bacteriano.
6.1 ANÁLISE DOS DADOS
Os testes serão realizados em triplicatas e anotados em planilhas. Posteriormente, os resultados serão ajustados e calculados através do software Statistica 6.0 (StatSoft).
Os dados serão redigidos sobre a forma de artigos científicos e trabalhos de conclusão de curso. Estes dados poderão ainda ser utilizados em experimentos in vivo, em projetos futuros de estudo de biodisponibilidade e ensaios de toxicidade.
7. RESULTADOS PARCIAIS
Os extratos aquosos de alho, gengibre e orégano, em duas concentrações diferentes, já foram produzidos. As respectivas concentrações dos extratos foram adotadas, uma vez que comprovadamente possuem atividade anti-bacteriana e anti-fúngica. Para evitar uma possível contaminação, os extratos aquosos precisam ser esterilizados para posteriormente serem adicionados ao meio de cultura para crescimento bacteriano.
Os integrantes do grupo de pesquisa têm se encontrado semanalmente para a realização de discussões de artigos científicos. Isto tem permitido a formação de um grupo de pesquisa para realização de estudos imunomoduladores dos extratos de plantas medicinais na FAG.
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS
No momento, nenhum resultado obtido pode garantir uma das metas deste projeto de pesquisa, entretanto acredita-se este possa servir para o desenvolvimento de um produto fitoterápico, que complementaria a terapia medicamentosa para o tratamento das infecções por Helicobacter pylori, principalmente aquelas relacionadas a úlcera gástrica e a gastrite.
O desenvolvimento deste projeto tem auxiliado na divulgação e formação do conhecimento em fitoterapia e uso racional de plantas medicinais. A comunidade pode beneficiar-se da sua utilização na terapia contra afecções gástricas, diminuindo os custos com a aquisição de medicamentos.
O projeto permitirá o desenvolvimento de formas farmacêuticas líquidas, para uso concomitante com a terapia anti-H. pylori convencional. Numa próxima etapa, após a finalização deste projeto, já vem sendo discutida a possibilidade de desenvolver testes in vivo, para avaliação da eficácia da atividade anti-microbiana destes extratos em modelos experimentais induzidos de gastrite e úlcera gástrica.
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